Synteza i badania strukturalne oligonukleotydów o sekwecjach ramion antykodontów tRNA zawierających nowe modyfikowane nukleozydy: ct6A, ms2ct6A, ges2U.
Synthesis and structural studies of oligonucleotides with tRNA anticodon stem-loop sequences containing newly discovered modified nucleosides: ct6A, ms2ct6A, ges2U
Typ projektu: naukowo-badawczy
Słowa kluczowe: biomolekularna spektroskopia NMR ct6A geranylowe 2-tiourydyny modyfikowane adenozyny modyfikowane nukleozydy tRNA ms2ct6A struktura RNA synteza oligorybonukleotydów
Słowa kluczowe (angielski): tRNA modified nucleosides oligoribonucleotide synthesis geranylated 2-thiouridines modified adenosines ct6A ms2ct6A RNA structure biomolecular NMR spectroscopy;
Członkowie konsorcjum: Politechnika Łódzka (Lodz University of Technology) Instytut Chemii Bioorganicznej PAN
Okres realizacji projektu: 21.02.2018 - 20.02.2022
Instytucja finansująca: Narodowe Centrum Nauki
Nazwa programu: Opus
Kierownik projektu: Elżbieta Sochacka
Wartość dofinansowania: 1 390 200,00 PLN
Wartość projektu: 1 390 200,00 PLN
„Synteza i badania strukturalne oligorybonukleotydów o sekwencjach ramion antykodonów tRNA, zawierających nowe modyfikowane nukleozydy: ct6A, ms2ct6A, ges2U.” Modyfikowane nukleozydy, licznie występujące w tRNA, odgrywają zasadniczą rolę w procesie dekodowania informacji genetycznej i biosyntezie białek. Obecnie znanych jest ponad 100 różnych modyfikacji tRNA. Ostatnio, w pętlach antykodonowych tRNA zidentyfikowano nowe interesujące modyfikowane jednostki: cykliczną N6-treonylokarbamoiloadenozynę (ct6A) i 2-metylotio-N6-treonylokarbamoiloadenozynę (ms2ct6A) oraz S-geranylowe pochodne 2-tiourydyn (ges2U*), jednakże funkcja biologiczna tych nukleozydów nie jest dotychczas poznana. Obecnie wiadomo, że cykliczne modyfikacje ct6A i ms2ct6A są wynikiem wewnątrzkomórkowej dehydratacji liniowych nukleozydów, t6A i ms2t6A, występujących powszechnie w 37 pozycji tRNA wszystkich organizmów. Oznacza to, że znane i badane od 40 lat t6A / ms2t6A mogą być artefaktami powstałymi w wyniku hydrolizy cyklicznych nukleozydów w procesie izolacji tRNA. Początkowo fragmentowi N6-treonylokarbamoilowemu ct6A przypisano strukturę oksazolonu (Myiauchi et al., Nat Chem Biol 2013, 9, 105), jednak nasze późniejsze badania jednoznacznie pokazały, że w natywnej formie ct6A fragment N6-treonylokarbamoilowy scyklizowany jest do pierścienia hydantoiny (Matuszewski et al. Nucleic Acids Res 2017, 45, 2137). Charakterystyczną cechą struktury ct6A jest skręcone ułożenie pierścienia hydantoiny względem reszty adeniny, kontrastująco różne od planarnego ułożenia reszty treoniny w strukturze t6A. Dotychczas właśnie takie planarne ułożenie uważane było za element decydujący o biologicznej funkcji t6A / ms2t6A w pozycji 37 tRNA. Fakt, że w strukturze ct6A pierścienie hydantoiny i adeniny nie mogą przyjąć ułożenia planarnego sprawia, że zaplanowane badania strukturalne modelowych fragmentów tRNA zawierających ct6A i ms2ct6A są wysoce aktualne i ważne dla wyjaśnienia roli tego nowego motywu modyfikacji w pozycji 37 tRNA. Inna grupa niedawno odkrytych modyfikacji tRNA to S-geranylowane 2-tiourydyny, które zostały zidentyfikowane w pozycji 34 bakteryjnych tRNA, obok występujących również w tej pozycji 2-tiourydyn i 2-selenourydyn. Dotychczas nie ma żadnych danych eksperymentalnych, które by pokazywały, jak obecność objętościowej, lipofilowej grupy geranylowej wpływa na strukturę pętli antykodonu. Zastosowanie metod spektroskopii NMR oraz modelowania komputerowego powinno dostarczyć informacji o orientacji przestrzennej grupy geranylowej w pętli antykodonowej oraz jej wpływie na strukturę pętli antykodonu w wybranym do badań modelowym ges2U-RNA. Cel badań: Celem projektu jest opracowanie syntezy modelowych oligonukleotydów o sekwencjach ramienia antykodonu (17-mery RNA), zawierających ct6A, ms2ct6A i ges2U oraz ich kompleksowe badania strukturalne metodami spektralnymi, w szczególności za pomocą spektroskopii NMR, prowadzące do wyjaśnienia wpływu nowych, unikatowych modyfikacji na funkcjonowanie cząsteczek tRNA. W celu lepszego poznania reaktywności ct6A i ms2ct6A, szczególnie w kontekście środowiska komórki, sprawdzimy ich stabilność po wprowadzeniu w łańcuch oligonukleotydowy, zarówno w środowisku wodnym (pH 5,5-8,0) jak i pod działaniem nukleofili azotowych (np. ε-NH2 lizyny). Celem syntetycznym projektu jest też opracowanie nowej ścieżki syntezy ct6A, prowadzącej bezpośrednio do hydantoinowej formy ct6A, bez występującego w obecnej metodzie etapu utworzenia najpierw t6A, a następnie jej dehydratacji do ct6A. Metody badawcze: Cele projektu zostaną osiągnięte poprzez wykorzystanie metodyki badań z zakresu syntetycznej chemii organicznej (w szczególności syntezy modyfikowanych nukleozydów i oligonukleotydów) oraz metodologii NMR stosowanych w badaniach struktury fragmentów RNA. Zespół konsorcyjny, kierowany przez prof. Elżbietę Sochacką z IChOrg PŁ (lider) oraz prof. Zofię Gdaniec z IChB PAN (partner), posiada udokumentowane doświadczenie do realizacji zadań przewidzianych w projekcie. Obie instytucje naukowe, w których prowadzane będą badania, posiadają odpowiednio wyposażone laboratoria syntezy organicznej oraz niezbędną aparaturę naukowo-badawczą. Spodziewane efekty i ich znaczenie: Realizacja zadań projektu pozwoli nam włączyć się w aktualny nurt badań nad nowoodkrytymi modyfikacjami w cząsteczkach tRNA. Dotyczy to zarówno zaproponowanej nowej ścieżki syntezy ct6A jak i opracowania syntezy szeregu 17-merowych oligonukleotydów o sekwencjach ramienia antykodonu (ASL) zawierających ct6A, ms2ct6A i ges2U, co stanowić będzie znaczący wkład w chemię modyfikowanych oligonukleotydów. Uważamy, że badania strukturalne przeprowadzone z wykorzystaniem modeli oligonukleotydowych, pozwolą odpowiedzieć na kluczowe pytanie w jaki sposób unikatowe motywy strukturalne obecne w tych modyfikacjach, to znaczy pierścień hydantoiny w strukturze ct6A i ms2ct6A czy lipofilowa grupa geranylowa w ges2U, wpływają na konformację pętli antykodonu, a w konsekwencji na biologiczne funkcjonowanie tej ważnej domeny strukturalnej tRNA.
-
Powrót