Synteza i badania strukturalne/biofizyczne modelowych oligomerów mRNA/mt-tRNA w celu określenia roli modyfikowanych nukleozydów (m5C, hm5C, f5C, ca5C, m1G) w translacji i chorobach człowieka
Synthesis and structural/biophysical studies of model mRna/mt-tRNA oligomers to evaluate the role of modified nucleosides(m5C, hm5C, f5C, ca5C, m1G) in translation and human diseases
Typ projektu: naukowo-badawczy
Słowa kluczowe: modyfikowane nuleozydy mRNNA/mt-tRNA synteza oligomerów RNA modyfikowane cytydyny modyfikowane guazozyny struktura RNA biomolekularyna spektroskopia NMR stabilność termodynamiczna RNA
Słowa kluczowe (angielski): mRNA/mt-tRNA modified nucleosides RNA oligomer synthesis modified cytidines modified guanosines RNA structure biomolecular RNA spectroscopy thermodynamic stability of RNAs
Członkowie konsorcjum: Politechnika Łódzka (Lodz University of Technology) Instytut Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk
Okres realizacji projektu: 21.07.2022 - 20.07.2026
Instytucja finansująca: Narodowe Centrum Nauki
Nazwa programu: Opus
Kierownik projektu: Grażyna Leszczyńska
Wartość dofinansowania: 1 783 934,00 PLN
Wartość projektu: 1 783 934,00 PLN
Modyfikowane nukleozydy występujące w cząsteczkach mRNA i tRNA są ważnymi elementami komórkowej maszynerii odpowiedzialnej za wydajną i prawidłową biosyntezę białek. Szczególnie istotną rolę odgrywają modyfikowane nukleozydy bezpośrednio zaangażowane w oddziaływania kodon-antykodon. Należy tu wymienić modyfikowane nukleozydy zlokalizowane w kodującym rejonie mRNA oraz w domenie ramienia antykodonu (ASL) cytozolowych i mitochondrialnych (mt) cząsteczek tRNA. Ponieważ mitochondria produkują ok. 90% energii wykorzystywanej przez komórkę stąd jakiekolwiek zakłócenia struktury mt-tRNA mogą być przyczyną poważnych chorób mitochondrialnych (np. MERRF, MELAS, LHON). W przeciwieństwie do cząsteczek tRNA, matrycowy RNA (mRNA) zawiera stosunkowo niewielką ilość modyfikowanych nukleozydów, jednakże ich znaczenie - zwłaszcza w regulacji procesów komórkowych jest szeroko dyskutowane w literaturze. Niezwykle istotną grupą takich modyfikacji są odkryte w ostatnim czasie modyfikacje epigenetyczne; ich dynamiczny i odwracalny charakter nasuwa przypuszczenie, że mogą one pełnić rolę regulatorową w procesie biosyntezy białek na poziomie mRNA. Cele i opis projektu. Wykorzystując chemicznie zsyntetyzowane oligomery RNA planujemy rozwiązać dwa złożone problemy naukowe dotyczące roli modyfikowanych nukleozydów mRNA i mt-tRNA w procesie translacji. Pierwszym celem projektu są epigenetyczne modyfikacje, zidentyfikowane w kodującym rejonie mRNA, wywodzące się z 5-metylocytydyny: 5-hydroksymetylocytydyna (hm5C), 5-formylocytydyna (f5C) i 5-karboksycytydyna (ca5C). Brak systematycznych badań nad regulatorową rolą tych modyfikacji w procesie translacji oraz ważność tego problemu skłoniły nas do przeprowadzenia kompleksowych badań biofizycznych i strukturalnych, umożliwiających określenie wpływu wymienionych cytydyn na właściwości i aktywność biologiczną modyfikowanych nimi cząsteczek RNA. W ramach Projektu planujemy potwierdzić eksperymentalnie zaproponowaną przez nas ścieżkę przemian hm5C-RNA, która wyjaśniłaby raportowany w literaturze spadek hm5C w komórkach nowotworach. Ponieważ hm5C pełni rolę regulatorową wydaje się, że zaobserwowany metabolizm może mieć istotne znaczenie biologiczne lub patogenne w kancerogenezie. Stosując syntetyczny hm5C-RNA oraz enzymy A3A, hSMUG1 i APE1 planujemy w warunkach in vitro wykonać trzy-etapową konwersję hm5C-RNA prowadzącą ostatecznie do rozszczepienia łańcucha RNA. Drugie zadanie Projektu koncentruje się wokół patogennych nukleozydów zidentyfikowanych w pozycji 37 hmt-tRNAMet w wyniku mutacji A4435→G w ludzkim mt-DNA. Zaobserwowano, że patogenna guanozyna G37 w kolejnym etapie ulega enzymatycznej metylacji do 1-metyloguanozyny (m1G). Oba patogenne nukleozydy są przyczyną poważnych dysfunkcji mitochondriów, które w przypadku niektórych pacjentów dają objawy nadciśnienia, cukrzycy typu 2 lub dziedzicznej neuropatii nerwu wzrokowego Lebera (LHON). Ostatnio udowodniliśmy, że podstawienie A37G37, a następnie m1G37 zmienia stabilność termiczną spinek ASL [ChemCommun, 2021, 57, 12540]. Postawiliśmy hipotezę, że oligomer G37-ASL tworzy super-stabilną spinkę z 4-nukleotydową pętlą, która (jeśli hipoteza jest słuszna) byłaby nieaktywna w procesie rozpoznania antykodon-kodon i hamowałaby biosyntezę białek. W Projekcie zaplanowaliśmy syntezę odpowiednio modyfikowanych oligonukleotydów w większej skali i ich wykorzystanie w kompleksowych badaniach biochemicznych i strukturalnych w celu określenia właściwości uszkodzonych cząsteczek hmt-ASLMet. Powody podjęcia tematu badawczego. Określenie regulacyjnej roli pochodnych m5C w procesie translacji jest ważne z kilku powodów: proces biosyntezy białek jest fundamentalny dla prawidłowego funkcjonowania komórek; zakłócenia tego procesu są przyczyną poważnych dysfunkcji w komórkach (zwłaszcza mózgu); obniżona zawartość hm5C w RNA komórek nowotworowych może się okazać patogenna i stymulować powstawania nowotworu; biologiczna rola f5C i ca5C nie została jak dotąd przedstawiona w literaturze. Z kolei badania nad patogennymi cząsteczkami mt-tRNAMet są istotne dla wyjaśnienia molekularnych przyczyn opisywanych dysfunkcji mitochondriów jak również objawów klinicznych jakie im towarzyszą. Mamy przekonanie, że udzielenie odpowiedzi na pytanie w jaki sposób wadliwe nukleozydy zmieniają strukturę/właściwości RNA umożliwi w przyszłości odkrycie nowych metod leczenia ludzi. Oczekiwane rezultaty. Biofizyczne i strukturalne badania z udziałem oligomerów zawierających epigenetyczne cytydyny poszerzą wiedzę na temat ich wpływu na właściwości hybrydyzacyjne RNA, selektywność parowania zasad oraz zmianę lokalnej/globalnej struktury RNA. Te dane pozwolą nam ocenić różnice pomiędzy poszczególnymi cytydynami, istotne dla określenia regulatorowej funkcji tych modyfikacji w komórce. Potwierdzenie zaproponowanej przez nas drogi metabolicznej hm5C w komórkach nowotworowych rzuci nowe światło na rolę modyfikacji w kontroli ekspresji informacji genetycznej w komórkach nowotworowych i/lub nieznaną do tej pory funkcję regulatorową enzymów A3A i hSMUG1. Badania strukturalne zdefektowanych hmt-ASLsMet oraz badania efektywności wiązania do mitorybosomu pomogą nam wyjaśnić udział patogennych nukleozydów w patogenezie chorób mitochondrialnych na poziomie molekularnym. Ponadto, w Projekcie planujemy opracować kilka nowych metod syntezy modyfikowanych oligomerów RNA których dostępność jak ważna nie tylko dla realizacji Projektu.
Modified nucleosides present in mRNA and tRNA nucleic acids are important elements of the cellular machinery responsible for effective and accurate protein biosynthesis. The major players of this machinery are modified nucleosides located at the coding region of mRNAs and the anticodon stem-loop domain (ASL) of cytosolic and mitochondrial (mt) tRNAs, directly attending the codon-anticodon interactions on the ribosome. Since mitochondria produce ~90% of the energy required by the cell, the structural perturbation of mt-tRNAs were found to cause several human diseases (e.g. MERRF, MELAS, LHON). In contrast to tRNAs, mRNA molecules contain a rather small number of modifications, but their importance in the regulation of cellular processes has been clearly demonstrated. Some of them, called epigenetic, were recently discovered to be dynamic and can play a critical regulatory role in protein biosynthesis. Project goals and research description. Based on the chemically synthesized model oligomers, we focus on two complex problems addressing the role of mRNA and mt-tRNA modifications in translation process. The first subject of our interest is epigenetic modifications derived from 5-methylcytidine: 5-hydroxymethylcytidine (hm5C), 5-formylcytidine (f5C) and 5-carboxycytidine (ca5C) identified in coding region of mRNA. It has been suggested that they play a regulatory role in the translation at the mRNA level, but there is no systematic research to date. Within the Project, we plan to perform the biophysical and structural characterization of suitably modified oligonucleotides to evaluate the impact of structurally distinct epigenetic cytidines on RNA properties and functionality. Furthermore, we plan to find the metabolic pathway of hm5C-RNA, which explains the reduced amount of this modification in cancer cells as compared to normal cells. Since hm5C regulates translation, decreased level of hm5C should have important biological or pathogenic consequences in the formation of cancer cells. In the Project, we hypothesize a possible hm5C metabolic pathway and plan to verify the proposed thesis through in vitro experiments with a synthetically obtained hm5C oligomer and a set of three enzymes (A3A, hSMUG1 and APE1) involved in cellular hm5C-RNA transformation. The second goal of our Project concerns two pathogenic nucleosides identified at the position 37 of hmt-tRNAMet, resulting from mutation A4435→G in human mt-DNA and subsequent enzymatic methylation G37→m1G37. Both pathogenic mutations cause severe mitochondrial dysfunction in some patients associated with hypertension, type 2 diabetes or Leber's hereditary optic neuropathy (LHON). Recently, we have proved that the replacement of conserved A37 to G37 and next to m1G37 alters the thermal stability of ASL hairpin motif, particularly in the case of G37-containing ASL, which was predicted to form a super-stable tetraloop hairpin [Chem.Commun., 2021, 57, 12540]. Within the project we plan to use appropriate oligonucleotide models for biochemical and structural studies to assess the properties of damaged hmt-ASLMet molecules. Reasons for attempting a particular research topic. Determining the effects of m5C, hm5C, f5C and ca5C mRNA modifications on translation process, including cancer cells is important for several reasons. Firstly, protein biosynthesis is a fundamental process in every cell and its disruption leads to severe cell dysfunctions. In particular, increased amounts of hm5C was observed in such important organs as the brain and heart. Moreover, the hm5C-regulatory role can be associated with cancer cells formation. Finally, the biological role of the f5C and ca5C modifications has not been investigated so far. Studies involving pathogenic human mt-tRNAMet seems essential to understand the molecular reasons for mitochondria dysfunctions and clinical symptoms reported for patients affected by the mutation A4435→G. We believe that a detailed understanding of how pathogenic modifications alter the structure/properties of RNA molecules will facilitate the development of new therapies for human diseases in the future. Substantial results expected. Biophysical and structural studies of RNA oligomers modified with m5C, hm5C, f5C and ca5C epigenetic modifications will broaden our understanding of their contribution to hybridization properties, base pairing discrimination and local/global structural changes. The obtained data will allow us to elucidate the differences between the modified cytidines which are important in the context of regulatory processes in the cells. Confirmation of the hypothesized hm5C metabolic pathway in cancer cells will provide new insight into the role of post-transcriptional modifications in the control of gene expression in cancer cells and/or shed new light on the unknown regulatory function of the used A3A and hSMUG1 enzymes. The structural studies of the pathogenic hmt-ASLsMet supported by ribosome binding experiments will allow us to understand the contribution of defective nucleosides to the pathogenesis of mitochondrial diseases at the molecular level. In addition to the above-mentioned results, we will develop several novel procedures of modified oligonucleotides syntheses which will be helpful not only in the implementation of the Project tasks.
Powrót